تشخیص اسید نوکلئیک ویروس

توالی ژنومی اکثر ویروس ها شناخته شده است.پروب های اسید نوکلئیک که بخش های کوتاهی از DNA هستند که برای هیبرید شدن با قطعات DNA یا RNA ویروسی مکمل طراحی شده اند.واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک روش کارآمدتر برای تشخیص ویروس است.روش های تشخیصی با توان بالا اخیراً توسعه یافته اند.

الف. تکنیک هیبریداسیون اسید نوکلئیک

هیبریداسیون اسید نوکلئیک، به طور عمده شامل ساترن بلات (Southern) و شمال بلات (Northern)، یک تکنیک جدید در حال توسعه سریع در زمینه تشخیص ویروس است.منطق سنجش هیبریداسیون استفاده از بخش های کوتاه DNA (به نام "کاوشگر") است که برای هیبریداسیون با قطعات DNA یا RNA ویروسی مکمل طراحی شده است.با حرارت دادن یا عملیات قلیایی، DNA یا RNA هدف دو رشته ای به رشته های منفرد جدا شده و سپس روی یک تکیه گاه جامد بی حرکت می شوند.پس از آن، پروب اضافه شده و با DNA یا RNA هدف هیبرید می شود.از آنجایی که کاوشگر با ایزوتوپ یا نوکلید غیر رادیواکتیو برچسب گذاری شده است، DNA یا RNA هدف را می توان از طریق اتورادیوگرافی یا سیستم بیوتین-آویدین شناسایی کرد.از آنجایی که بیشتر ژنوم‌های ویروسی شبیه‌سازی و توالی‌یابی شده‌اند، می‌توان آنها را با استفاده از توالی‌های خاص ویروس به عنوان پروب در نمونه شناسایی کرد.در حال حاضر روش‌های هیبریداسیون عبارتند از: لکه‌های نقطه‌ای، هیبریداسیون درجا در سلول‌ها، DNA blotting (DNA) (Southern blot) و RNA blotting (RNA) (نورترن بلات).

فناوری B.PCR

در سال‌های اخیر، مجموعه‌ای از تکنیک‌های تقویت اسید نوکلئیک در شرایط آزمایشگاهی بر اساس PCR، برای آزمایش ویروس‌های غیر حساس یا غیرقابل کشت توسعه یافته‌اند.PCR روشی است که می تواند توالی DNA خاصی را با واکنش پلیمراز آزمایشگاهی سنتز کند.فرآیند PCR شامل یک چرخه حرارتی از سه مرحله است: دناتوراسیون، بازپخت و گسترش در دمای بالا (93 ℃ ~ 95 درجه سانتیگراد)، DNA دو رشته ای به دو رشته DNA منفرد جدا می شود.سپس در دمای پایین (37℃~60℃)، دو آغازگر نوکلئوتیدی سنتز شده به بخش‌های DNA مکمل آنیل می‌شوند.در حالی که در دمای مناسب برای آنزیم Taq (72 درجه سانتیگراد)، سنتز زنجیره‌های DNA جدید از انتهای آغازگر 3 با استفاده از DNA مکمل به عنوان الگو و تک نوکلئوتیدها به عنوان مواد آغاز می‌شود.بنابراین پس از هر چرخه، یک زنجیره DNA را می توان به دو زنجیره تقویت کرد.با تکرار این فرآیند، هر زنجیره DNA سنتز شده در یک چرخه می تواند به عنوان الگو در چرخه بعدی استفاده شود، و تعداد زنجیره های DNA در هر چرخه دو برابر می شود، به این معنی که تولید PCR با سرعت log 2n تقویت می شود.پس از 25 تا 30 سیکل، تولید PCR از طریق الکتروفورز شناسایی می شود و محصولات DNA خاص را می توان تحت نور UV (254 نانومتر) مشاهده کرد.به دلیل ویژگی، حساسیت و راحتی، PCR در تشخیص بالینی بسیاری از عفونت های ویروسی مانند HCV، HIV، CMV و HPV به کار گرفته شده است.از آنجایی که PCR بسیار حساس است، می تواند DNA ویروس را در سطح fg تشخیص دهد، برای جلوگیری از مثبت کاذب، عمل باید بسیار با دقت انجام شود.علاوه بر این، نتیجه مثبت در آزمایش اسید نوکلئیک به معنای وجود ویروس عفونی زنده در نمونه نیست.

با کاربرد گسترده تکنیک PCR، تکنیک‌ها و روش‌های جدیدی بر اساس تکنیک PCR برای اهداف مختلف آزمایش توسعه داده می‌شوند.به عنوان مثال، PCR کمی زمان واقعی می تواند بار ویروسی را تشخیص دهد.in situ PCR برای شناسایی عفونت ویروسی در بافت یا سلول استفاده می شود.PCR تو در تو می تواند ویژگی PCR را افزایش دهد.در میان آنها، PCR کمی زمان واقعی با سرعت بیشتری توسعه یافته است.بسیاری از تکنیک‌های جدید، مانند پروب هیدرولیز TaqMan، پروب هیبریداسیون، و پروب فانوس مولکولی، در روش Real Time کمی PCR ترکیب شده‌اند که به طور گسترده در تحقیقات بالینی مورد استفاده قرار می‌گیرد.علاوه بر شناسایی دقیق بار ویروسی در مایع بدن بیماران، می توان از این روش برای تشخیص جهش مقاوم به دارو نیز استفاده کرد.بنابراین، زمان واقعی PCR کمی عمدتا در ارزیابی اثر درمانی و نظارت بر تحمل دارو استفاده می شود.

ج. تشخیص بازده بالای اسیدهای نوکلئیک ویروسی

برای رفع نیازهای تشخیص سریع بیماری‌های عفونی جدید، روش‌های مختلف تشخیص با توان بالا، مانند تراشه‌های DNA (DNA) ایجاد شده‌اند.برای تراشه‌های DNA، پروب‌های خاصی سنتز می‌شوند و به تراشه‌های سیلیکونی کوچک با چگالی بسیار بالا متصل می‌شوند تا ریزآرایه پروب DNA (DNA) را تشکیل دهند که می‌تواند با نمونه هیبرید شود.سیگنال هیبریداسیون را می توان با میکروسکوپ کانفوکال یا اسکنر لیزری تصویربرداری کرد و توسط کامپیوتر بیشتر پردازش شد و مجموعه داده های عظیم مربوط به ژن های مختلف را می توان به دست آورد.دو نوع تراشه DNA وجود دارد."تراشه سنتز" به شرح زیر است: الیگونوکلئوتیدهای خاص مستقیماً روی تراشه ها سنتز می شوند.دیگری چیپ استخر DNA است.ژن های کلون شده یا محصولات PCR به ترتیب بر روی اسلاید چاپ می شوند.مزیت فناوری تراشه DNA، تشخیص همزمان مقدار زیادی از توالی های DNA است.آخرین نسخه تراشه تشخیص پاتوژن می تواند بیش از 1700 ویروس انسانی را به طور همزمان شناسایی کند.فناوری تراشه DNA مشکلات روش‌های سنتی هیبریداسیون اسید نوکلئیک را حل کرده و کاربردهای بسیار گسترده‌ای در تشخیص ویروسی و مطالعات اپیدمیولوژیک دارد.